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RNA總提取液

发表时间:2014-10-23 浏览次数:3001  【關閉

TRIpure試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿後離心,樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層後,RNA可以通過異丙醇沈澱來還原。在除去水樣層後,樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沈澱的方式還原。乙醇沈澱能析出中間層的DNA,在有機層中加入異丙醇能沈澱出蛋白。共純化DNA對于樣品間標准化RNA的産量十分有用。無論是人、動物、植物還是細菌組織,該方法對少量的組織(20-100mg)和細胞(5×106)以及大量的組織(≥1g)和細胞(>107均有較好的分離效果。TRIpure試劑操作上的簡單性允許同時處理多個的樣品。所有的操作可以在一小時內完成。TRIpure抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的汙染。故而能夠滿足RNA印迹分析、斑點雜交、poly(A)+選擇、體外翻譯、RNA酶保護分析和分子克隆等各類生物分子學實驗需求。

注意事項:
1. 当TRIpure用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。
2. 当TRIpure用量较大时,可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管,事先检验以确保该试管可以耐受加入TRIpure和氯仿后12,000×g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。
3. 离心前小心平衡试管。
4. 离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口,聚丙烯管必须盖紧。
5. 从少量的组织(1~10mg)或细胞(102~104)中分离RNA样品:往组织或细胞中加800µlTRIpure。待样品裂解后,加入氯仿并进行步骤2中的抽提操作。在用异丙醇沉淀RNA之前,加入5~10μg无RNA酶的glycogen作为水样层的载体。为降低其黏度在加入氯仿前用26号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。Glycogen会留在水样层中并和RNA共析出。在浓缩到4mg/ml之前它不会抑制逆转录反应第一链的合成也不会抑制PCR。
6. 在匀化后和加入氯仿之前,样品可以在–60~–70°C保存至少一个月。RNA沉淀(步
驟4,RNA漂洗)溶于75%的乙醇在2~8°C至少可以保存一周,在–5~–20°C下至少可保存一年。
7. 台式离心机最大能达到2,600×g的离心力,如果将离心时间延长到30~60分钟可
以滿足步驟2和步驟3中的操作。

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